Трое ученых внесли огромный вклад в технологию, которая позволяет заглянуть в живые молекулы и рассмотреть их с точностью до атома Трое ученых внесли огромный вклад в технологию, которая позволяет заглянуть в живые молекулы и рассмотреть их с точностью до атома
Жак Дюбоше, Йоахим Франк и Ричард Хендерсон объявлены лауреатами Нобелевской премией по химии за 2017 год. Награда присуждена им за разработку эффективного метода построения трехмерных изображений « молекул жизни ». При помощи созданной ими криоэлектронной микроскопии ученые теперь могут замораживать биомолекулы в движении и отображать их на своем оборудовании с точностью до атома. Эта технология привела к началу новой эры в биохимии
В последние годы в научной литературе появилось подробное описание множества удивительных структур живой молекулярной машинерии. К примеру, игла сальмонеллы, с помощью которой та атакует клетки. Или белок, который придает клеткам устойчивость к химиотерапии или антибиотикам. Были « сфотографированы » молекулярные комплексы, регулирующие циркадные ритмы (об этих ритмах подробнее в статье о Нобелевской премии по медицине), светозахватывающий комплекс, участвующий в фотосинтезе у растений, и сенсор давления, который одновременно помогает людям слышать. И это всего лишь несколько примеров из великого множества биомолекул, которые удалось увидеть при помощи криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).
Когда исследователи в Бразилии начали подозревать, что вирус Зика вызвал в стране эпидемию, из-за которой на свет стали появляться младенцы с серьезным повреждением мозга, они использовали крио-ЭМ, чтобы визуализировать невидимого врага. В течение нескольких месяцев ученые изучали трехмерные изображения этого вируса, сгенерированные с разрешением атомного масштаба, чтобы найти в нем уязвимое место – потенциальную цель для фармацевтических препаратов.
Изображение – важный ключ к знанию
В первой половине ХХ века биомолекулы – белки, ДНК и РНК – были terra incognita на карте биохимии. Ученые знали, что они играют фундаментальные роли в клетках, но понятия не имели, как выглядели эти молекулы. Только в 1950-х годах, когда исследователи из Кембриджа начали подвергать кристаллы белка рентгеновскому излучению, впервые удалось визуализировать их извилистые и спиральные структуры.
В начале 1980-х годов использование рентгеновской кристаллографии было дополнено использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для изучения белков в твердом состоянии и в растворе. Этот метод не только раскрыл их структуру, но также показал, как они перемещаются и взаимодействуют с другими молекулами.
Благодаря этим двум методам ученые сегодня располагают базами данных с информацией о тысячах моделей молекул, которые используется повсеместно – от фундаментальных исследований до развития фармацевтики. Однако оба метода имеют серьезные ограничения. ЯМР в растворе работает только для относительно небольших белков. Для рентгеновской кристаллографии требуется, чтобы молекулы образовывали хорошо организованные кристаллы, такие, как замерзшая до состояния льда вода. Кроме того, полученные с помощью этих методов изображения больше похожи на старинные черно-белые портреты – они неподвижны и очень мало рассказывают о динамике белка.
Кроме того, многие молекулы не выстраиваются в кристаллах, а это привело в 1970-е годы к тому, что Ричард Хендерсон отказался от рентгеновской кристаллографии. И именно с этого момента начинается история Нобелевской премии 2017 года по химии.
Проблемы с кристаллами заставляют Хендерсона пойти другим путем
Ричард Хендерсон получил докторскую степень в стенах бастиона рентгеновской кристаллографии – Кембриджского университета в Великобритании. Он использовал метод визуализации белков, но проблемы возникали, когда он пытался кристаллизовать белок, естественным образом встроенный в мембрану, окружающую клетку.
Мембранные белки, когда их удаляли из естественной среды – клеточной мембраны, – часто собирались в непригодную для изучения массу. Первый мембранный белок, с которым работал Ричард Хендерсон, трудно было производить в достаточных количествах; второй не смог кристаллизоваться. После долгих лет разочарований он обратился к единственной доступной альтернативе – электронному микроскопу.
Действительно ли электронная микроскопия была эффективной в то время – до сих пор открытый вопрос. Просвечивающий электронный микроскоп, доступный тогда ученому, работал по принципу обычного микроскопа, только пропускал через образец не луч света, а пучок электронов. Длина волны электронов намного короче, чем у света, поэтому электронный микроскоп может делать видимыми очень маленькие структуры – даже распознавать положение отдельных атомов.
Теоретически разрешение электронного микроскопа было более чем достаточным для Хендерсона, который пытался изучить атомную структуру мембранного белка, но на практике это оказалось почти невозможным. Когда в 1930-х годах был изобретен электронный микроскоп, ученые считали, что он подходит только для изучения мертвой материи. Мощный электронный пучок, необходимый для получения изображений с высоким разрешением, сжигал биологический материал, а более слабый делал изображение нечетким и недостаточно контрастным.
Вдобавок электронная микроскопия требует вакуума – условия, при котором биомолекулы разрушаются, потому что окружающая их вода испаряется. Они высыхают и теряют свою естественную структуру, что делает полученное изображение непригодным.
Почти все обстоятельства указывали на то, что Ричард Хендерсон потерпит неудачу в своих исследованиях. Но неожиданно проект спас специальный белок, который он выбрал для изучения. Это был бактериородопсин.
Новости по теме: Космический щебет гравитационных волн. За что дали Нобелевскую премию по физике в 2017 году
Лучших технологий оказалось недостаточно для Хендерсона
Бактериородопсин – это белок фиолетового цвета, встроенный в мембрану организма, осуществляющего фотосинтез. Задача этого белка – захватывать энергию солнечных лучей. Вместо удаления чувствительного белка из мембраны, как ранее пытался это сделать Ричард Хендерсон, он и его коллега взяли целую фиолетовую мембрану и положили ее под электронный микроскоп. Так белок оставался в своей естественной среде и сохранял структуру. Для защиты образца от высыхания в вакууме исследователи покрыли его поверхность раствором глюкозы.
Безжалостный пучок электронов был проблемой, но ученые воспользовались тем, как молекулы бактериородопсина упаковываются в мембрану организма. Вместо того, чтобы взорвать его полной дозой электронов, они пустили более слабый луч через образец. Изображение было недостаточно контрастным, и разглядеть отдельные молекулы не получалось. Но ученые воспользовались знанием того, что эти белки обычно располагаются и ориентируются в мембране в одном направлении. Когда все белки отразили пучок электронов практически идентичным образом, они смогли просчитать более детализированное изображение на основе дифракционной картины. Похожий математический подход был использован и для рентгеновской кристаллографии.
На следующем этапе исследователи развернули мембрану под электронным микроскопом, снимая ее с разных ракурсов. Таким образом, в 1975 году удалось создать грубую трехмерную модель структуры бактериородопсина, которая показала, как белковая цепь несколько раз прошла сквозь мембрану.
Это было лучшее изображение белка, когда-либо созданное с помощью электронного микроскопа. Многие были впечатлены разрешением в 7 ангстрем (0,0000007 миллиметра), но этого было недостаточно для Ричарда Хендерсона. Его целью было достичь разрешения такого же, как при рентгеновской кристаллографии, примерно в 3 ангстрема, и он был убежден, что электронная микроскопия может этого добиться.
Хендерсон получает первое изображение с разрешением атомного масштаба
В последующие годы электронная микроскопия постепенно усовершенствовалась. Были улучшены линзы, развивалась криотехнология (мы вернемся к этому). Образцы для исследования стали охлаждать жидким азотом, защищая их таким образом от повреждения пучком электронов.
Ричард Хендерсон постепенно добавлял новые детали к модели бактериородопсина. Чтобы получить максимально четкие изображения, он ездил по миру, чтобы поработать в лабораториях с самыми лучшими электронными микроскопами. У каждого из них были свои недостатки, но они дополняли друг друга. Наконец, в 1990 году, через 15 лет после публикации первой модели, Хендерсон достиг своей цели и смог представить структуру бактериородопсина в разрешении атомного масштаба.
Таким образом, он доказал, что крио-ЭМ может обеспечивать изображения столь же детализированные, как и при использовании рентгеновской кристаллографии. Это была важная веха. Тем не менее, весь прогресс был построен на частном случае: естественном расположении белка в мембране. Совсем немного других белков самопроизвольно располагаются таким образом. Встал вопрос обобщения метода: можно ли использовать электронный микроскоп для создания трехмерных изображений с высоким разрешением для белков, случайным образом рассеянных в образце и ориентированных в разных направлениях? Ричард Хендерсон полагал, что можно, в то время как другие ученые считали это утопией.
На другой стороне Атлантики, в Департаменте здравоохранения штата Нью-Йорк, Йоахим Франк долго работал над решением именно этой проблемы. В 1975 году он представил теоретическую стратегию, в которой возможно минимальная информация, обнаруженная на двухмерных изображениях с электронного микроскопа, может быть объединена для создания трехмерной картинки с высоким разрешением. Ему потребовалось более десяти лет, чтобы воплотить эту идею.
